民族药地胆草有效成分咖啡酸乙酯抑制Th1细胞介导抗胶原关节炎作用机制的研究

  2017-09-27  国医在线  阅读   

万春平 左爱学 徐世奎 郑喜 祁燕 李小丝 李兆福 彭江云

(云南中医学院第一附属医院中心实验室  云南中医学院中药学院 云南省药检所  云南中医学院第一附属医院风湿科)

(本论文荣获“第四届兰茂论坛”优秀论文一等奖)

  摘要 目的:研究咖啡酸乙酯抗类风湿关节炎的作用及通过Th1细胞介导抗胶原关节炎的作用机制,为民族药地胆草临床应用于类风湿关节炎和传承与创新奠定基础。方法:构建淋巴细胞增殖细胞模型和牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎(collagen induced arthritis,CIA)模型,按临床评分平均分为CIA模型组、甲氨蝶呤阳性组和咖啡酸乙酯给药组,石蜡切片H&E染色检测CIA小鼠关节炎病理损伤程度;酶联免疫吸附法检测胶原诱导脾淋巴细胞细胞因子的产生水平;流式细胞术检测淋巴细胞表面标志、胞内Th1、Th17和Treg细胞表达水平。体外构建Th1细胞分化模型,流式细胞术检测咖啡酸乙酯对Th1细胞分化的影响。荧光定量PCR检测IFN-g产生相关通路的基因表达水平(IFN-g,T-bet,STAT1和STAT4)。

  结果:咖啡酸乙酯浓度依赖性抑制丝裂原ConA和TCR诱导的T淋巴细胞增殖活性;咖啡酸乙酯口服给药能显著降低CIA小鼠胶原关节炎的临床评分,明显改善CIA小鼠局部关节炎的症状(P<0.05),减少CD11b+Gr-1+中性粒细胞浸润和胶原诱导脾淋巴产生Th1细胞因子(IFN-g)产生水平,抑制CIA模型小鼠脾淋巴细胞胞内IFN-g的表达(P<0.05)。与体内实验结果一致,薯蓣皂苷干预显著抑制Th1细胞体外分化,下调IFN-g产生通路IFN-g,T-bet,STAT1和STAT4的mRNA表达水平。

  结论:民族药地胆草免疫抑制成分咖啡酸乙酯具有显著的抗关节炎的作用,其作用机制与抑制Th1细胞分化及IFN-g产生通路有关,该研究为民族药地胆草临床应用于类风湿关节炎奠定基础。

  结论:地胆草;咖啡酸乙酯;类风湿关节炎;胶原关节炎;辅助性Th1细胞;Interferon–g

  地胆草,为菊科地胆草属植物地胆草Elephantopus scaber L.具有清热解毒,利尿消肿等功效,也是傣族、苗族、彝族等少数民族的常用药。临床主要用于感冒、急性扁桃体炎、咽喉炎、眼结膜炎、流行性乙型脑炎、慢性肾炎和关节炎等[1-2]。现代研究表明地胆草具有解热、保肝、抗菌、抗炎、抗肿瘤、酶抑制、心血管和胃肠道保护等广泛的药理活性[3]。前期我们从该植物中分离出15个化合物,并对其免疫活性进行筛选,首次发现咖啡酸乙酯具有显著的免疫抑制活性[4]。最新研究表明,咖啡酸乙酯亦具有抗炎作用[5]。这些结果提示,地胆草免疫抑制活性成分咖啡酸乙酯在自身免疫性疾病(如类风湿关节炎)具有潜在的治疗作用。

  胶原诱导的DBA/1小鼠关节关节炎(CIA)是用于研究人类类风湿性关节炎(RA)最经典、成熟的实验动物模型,在发病机理、疾病症状和病理特征上与RA都具有共同点,在国际上广泛应用于治疗类风湿关节炎药效评价和作用机理的研究[6]。本研究进一步在胶原关节炎小鼠模型上,研究地胆草免疫抑制活性成分咖啡酸乙酯通过抑制Th1免疫反应而介导治疗类风湿关节炎的作用机理,为民族药地胆草临床应用于类风湿关节炎和传承与创新奠定理论基础。

  1.实验材料

  1.1动物 C57BL/6小鼠,雌性,7-8周龄,体重18g左右; DBA/1小鼠,雄性7-8周龄,体重20g左右,均购自成都达硕生物科技有限公司,合格证号SCXK(川) 2008-24;动物饲养在SPF级动物房,实验动物至少饲养1周后使用。温度(22±1)℃,湿度55%±5%,12h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。

  1.2 主要药物与试剂

  咖啡酸乙酯由云南中医学院中药学院左爱学博士提供,呈白色粉末,纯度99%;RPMI-1640培养基购自GibcoBRL公司 (life Technologies,Grandisland,NY,USA);胎牛血清(fetal bovine serum)购自Hyclone 公司 (Logan,Utah,USA) ;牛II型胶原、弗氏完全佐剂(CFA)均购自Sigma公司(St.Louis.MO,USA);IFN-g、IL-10,IL-6,IL-4, TNF-a细胞因子ELISA检测试剂盒购自BD PharMingen 公司(San Diego,CA,USA),IL-17A ELISA检测试剂盒来自eBioscience公司(San Diego,CA,USA);其他试剂为国产分析纯。

  1.3实验仪器

  Veriti PCR扩增仪购自美国ABI公司:MX3000P核酸扩增荧光检测仪来自美国Aglient公司;离心机购自德国Thermo Scientific Heraeus;RM2235石蜡切片机、EG1150H+EG1130C组织包埋机、HI1210烘片机、DM2500正置显微镜和ASP300S全自动组织脱水机均购自德国莱卡仪器有限公司;3111二氧化碳培养箱购自美国Thermo-fisher;流式细胞仪购自美国BD公司。

  2. 实验方法及评价

  2.1 胶原关节炎小鼠的诱导、分组及给药

  DBA/1小鼠胶原关节炎的诱导参照文献制备[6],具体方法:牛II型胶原加入0.1M的醋酸,浓度10mg/ml,提前1天4℃冰箱溶解,胶原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化,待雄性DBA/1小鼠麻醉后,于其尾根部进行致敏,每只50ml/只,3周后以相同剂量进行再次免疫攻击,肉眼观察小鼠四肢,对关节炎的严重程度进行0-4级评分,每组小鼠四肢评分总和除以小鼠只数,取平均值作为临床评分。[0-4级评分系统:0=正常;1=一个或多个趾关节红或红肿;2=踝关节以下中度红肿;3=包括膝关节在内的严重红肿;4=包括膝关节在内的完全红肿,关节变形、残废。每只小鼠最多评分为16分]。第0天即为攻击当天。

  2.1.1实验分组及给药

  攻击9天后,对发病小鼠评分,按照临床评分平均分为关节炎病理模型组,阳性药甲氨蝶呤(MTX)(2mg/kg)给药组,咖啡酸乙酯(50mg/kg)给药组。关节炎病理模型组、阳性药MTX给药组分别给予溶剂对照和MTX 2mg/kg,咖啡酸乙酯组灌胃给予咖啡酸乙酯50mg/kg。以上给药组均在攻击9天后分组后开始给药,1次/天。

  2.1.2观察指标与检测方法

  2.1.3脾淋巴细胞的制备

  小鼠脾淋巴细胞制备参照文献[7],简言之。小鼠脱脊椎处死,无菌取其脾脏。将脾脏用玻璃片磨碎,过膜,于1200 rpm离心5分钟。弃去上清,沉淀加入红细胞裂解液(每个脾脏约1ml),混匀,静置1分钟,加入PBS,离心。再加入PBS,过膜,离心。将所剩细胞洗涤1-2次后,用含10%FBS的RPMI-1640将细胞调至所需浓度。

  2.1.4 CCK-8法测定T细胞抗原特异性反应

  制备各组小鼠淋巴细胞,接种于96孔板(4×105个/孔),同时加入II型胶原(200mg/ml)进行刺激,细胞于含5%CO2培养箱中培养24 h,CCK-8法测定淋巴细胞的增殖情况。

  2.1.5 组织病理学检查

  小鼠处死后,取其后肢,加入10%福尔马林进行固定,然后脱钙和进行石蜡包埋,切片(4mm厚度),苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色后显微镜下观察。

  2.1.6 ELISA法检测CIA小鼠胶原(CII)诱导淋巴细胞的细胞因子产生水平

  制备各组小鼠淋巴细胞,4×106个/ml与CII胶原共培养48h,收集细胞培养上清,ELIS A法检测细胞因子IFN-g,IL-4,IL-10,IL-17A,TNF-a和IL-6产生水平,检测方法见试剂盒说明书。

  2.1.7 流式细胞术检测

  流式细胞术检测参照文献[8-9],简言之。收集各组脾淋巴细胞,冼液冼2次,加入IgG抗体,封闭FcR,加入荧光标记抗小鼠CD4、CD8、B220、CD11b和Gr.1抗体,进行表面标志染色,流式细胞仪检测,Flowjo软件分析。对胞内细胞因子染色:各组小鼠淋巴结、脾淋巴细胞与PMA、Ionomycin以及BFA于5%CO2培养箱中共培养4h后,收集细胞,冼液冼2次,加入IgG抗体,封闭FcR,进行表面标志染色。完毕后,固定、穿膜,加入荧光标记的抗IL-17、IFN-g抗体,流式细胞仪检测分析。对于胞内特异转录因子Foxp3的检测,无需上述刺激,按胞内细胞因子染色检测。

  2.2 脾淋巴细胞增殖功能及细胞毒性检测

  2.2.1 MTT法检测咖啡酸乙酯的细胞毒性

  小鼠脾脏淋巴细胞 (4×105个/孔) 接种于96孔板,加入不同浓度的咖啡酸乙酯,另设相应的溶剂对照及培养液本底对照,于37℃,5% CO2培养箱中作用48h每孔加入20 ml 5mg/ml的 MTT,继续培养4h,吸弃培养液,加入150 ml DMSO终止反应,于震荡器震荡10分钟,使甲肷结晶完全溶解,酶标仪570 nm波长测定吸光度OD值。

  2.2.2 CCK-8法测定丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能

  小鼠脾脏淋巴细胞 (4×105个/孔) 接种于96孔板,加入不同浓度的咖啡酸乙酯,同时加入ConA (终浓度1mg/ml)或LPS (终浓度10mg/ml),另设无刺激剂的本底对照。于37℃,5% CO2培养箱中作用48h,CCK-8法检测丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能。

  2.3 荧光定量PCR (q-PCR)检测

  纯化CD4+T的淋巴细胞与1、3 mM的咖啡酸乙酯在anti-CD3(5mg/ml) +anti-CD28 Ab (1mg/ml)刺激下共培养16 h,抽提各组淋巴细胞,应用Trizol试剂盒提取总RNA,按Takara逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。尔后应用SYBR GreenI嵌合荧光法在实时定量PCR仪进行Th1细胞相关基因(IFN-g,T-bet,STAT1 和 STAT4 mRNA)表达检测,相关引物由上海生物工程有限公司合成公司合成。在PCR反应程序结束后,进入仪器自带软件的数据分析界面,设置β-actin为内参基因,仪器自动计算出各实验组基因表达差异倍数及标准差,即2-△△Ct±标准差值。特异基因引物系列如下:

  IFN-g: (sense) 5'-ATGAACGCTACACACTGCATC-3';

  (anti-sense) 5'- CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3';

  T-bet: (sense) 5'- CCAGGAAGTTTCATTTGGGAAGC-3';

  (anti-sense) 5'-ACGTGTTTAGAAGCACTG-3';

  STAT1: (sense) 5'- TCACAGTGGTTCGAGCTTCAG-3';

  (anti-sense) 5'-CGAGACATCATAGGCAGCGTG-3';

  STAT4: (sense) 5'- GCAGCCAACATGCCTATCCA -3';

  (anti-sense) 5'- TGGCAGACACTTTGTGTTCCA -3';

  β-actin: (sense) 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3',

  (anti-sense) 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.

  2.3 Th1体外诱导分化

  Th1体外诱导分化参照文献[10],采用免疫磁珠法分离CD4+T cell,CD4+T细胞接种在anti-CD3 mAb/anti-28 mAb包被的24孔培养板上,分别加入IL-12和anti-mIL-4,诱导CD4+T细胞向Th1细胞亚群方向分化。72h后,流式细胞术检测胞内IFN-g表达水平,检测方法同上。

  2.4 统计分析

  所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析,数据统计均以平均值±标准差表示,以P﹤0.05为显著水平。数据统计分析采用SPSS17.0统计软件包。

  3.实验结果

  3.1 咖啡酸乙酯体外抑制淋巴细胞的增值功能

  淋巴增殖实验结果显示,咖啡酸乙酯浓度依赖性抑制丝裂原ConA和TCR诱导的T淋巴细胞增殖,差异有显著性意义(P﹤0.05或0.01),体外显示出对T淋巴细胞较好的免疫抑制效应(P﹤0.05)。咖啡酸乙酯仅在浓度10 mM抑制细菌脂多糖诱导的B淋巴细胞增殖。细胞毒性结果显示,咖啡酸乙酯浓度在10 mM无明显细胞毒性作用(P﹥0.05)。

  3.2 咖啡酸乙酯口服给药改善小鼠胶原诱导关节炎的损伤程度

  图2 结果显示,与CIA模型组比较,咖啡酸乙酯口服给药显著降低胶原关节炎小鼠临床评分,差异有显著性意义(P<0.05)。关节炎组织病理切片结果表明,模型组小鼠关节破坏及骨破坏严重,关节有大量的炎性细胞浸润,滑膜细胞增生明显。而咖啡酸乙酯给药组和MTX组小鼠关节炎病理损伤程度轻于模型组,滑膜间质炎症细胞浸润少于病理模型,关节破坏及骨破坏相对较轻。

  3.3 咖啡酸乙酯口服给药抑制CIA小鼠胶原(CII)特异性免疫应答

  图3结果显示,咖啡酸乙酯药物干预组和MTX药物干预组小鼠淋巴细胞胶原诱导的增殖活性显著低于CIA模型组,差异有显著性意义(P<0.01)。ELISA检测结果显示,与CIA模型组比较,咖啡酸乙酯药物干预显著抑制胶原诱导淋巴细胞IFN-g和IL-6产生水平,差异有显著性意义(P<0.01);咖啡酸乙酯药物干预对IL-4和TNF-a的产生水平无明显影响(P>0.01)。

  3.4 咖啡酸乙酯口服给药显著减少中性粒细胞的表达和集聚

  流式表面染色结果表明,薯蓣皂苷口服给予20mg/kg药物干预并不影响CIA小鼠脾淋巴细胞CD4+T细胞、CD8+T细胞和B220+细胞的表达。然而,与CIA模型组比较,CD11b+Gr-1+中性粒细胞比例和绝对细胞数在咖啡酸乙酯给药组是下调的,经统计学分析,差异有显著性意义(P<0.05)。

  3.5咖啡酸乙酯口服给药特异性抑制胶原关节炎小鼠脾淋巴细胞Th1的表达

  流式细胞术检测脾淋巴细胞CD4+ T细胞亚群Th1(IFN-γ)、Th17(IL-17A)及Treg细胞的表达水平。结果显示,与CIA模型对照组比较,咖啡酸乙酯药物干预后, Th1(IFN-g)表达显著下调,差异有显著性意义(P<0.05),而Th17 (IL-17A) 和Treg细胞表达无显著变化(P>0.05),提示咖啡酸乙酯特异性抑制Th1细胞免疫反应。

  3.6咖啡酸乙酯抑制Th1细胞体外分化

  体内CIA关节炎模型小鼠上显示,咖啡酸乙酯干预特异性抑制Th1细胞免疫反应,为进一步揭示其对Th1细胞的作用。我们采用免疫磁珠分离法(阴性选择) 从小鼠脾淋巴细胞富集CD4+T细胞,纯化CD4+T细胞在Th1细胞极化条件下诱导分化生成Th1细胞。流式细胞检测结果显示,与体内实验结果一致,在Th1体外分化细胞模型中,咖啡酸乙酯干预显著抑制了Th1的分化。

  3.7 咖啡酸乙酯抑制Th1细胞及IFN-g产生相关通路

  最新研究表明,Th1细胞因子IFN-g在RA患者和疾病模型病理机制中起着关键作用,为进一步揭示咖啡酸乙酯对IFN-g产生相关通路,我们应用荧光定量PCR检测IFN-g产生相关通路的基因表达水平。结果显示,咖啡酸乙酯显著抑制IFN-g,T-bet, STAT1和STAT4的基因表达水平。

  讨论

  类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是常见的以慢性关节性病变为主要表现,以T细胞反应为主的自身免疫性疾病[11-12]。该病具有迁延日久、延绵难治的特点,是当今世界医学领域的难题。自身免疫性的T淋巴细胞激活和增殖参与到多种自身免疫性疾病的发病机制中,其中包括类风湿关节炎[13]。前期研究已表明,咖啡酸乙酯显著抑制丝裂原Con A和TCR诱导的T淋巴细胞增殖,且无明显的细胞毒性。提示咖啡酸乙酯具有治疗自身免疫性疾病的潜在价值,值得进一步研究。

  胶原诱导的DBA/1小鼠关节关节炎(CIA)是用于研究人类类风湿性关节炎(RA)最经典、成熟的实验动物模型,在发病机理、疾病症状和病理特征上与RA都具有共同点,在国际上广泛应用于治疗类风湿关节炎药效评价和作用机理的研究[6]。实验结果表明,咖啡酸乙酯药物干预后显著降低胶原关节炎小鼠临床评分;在病理损伤程度方面,显著减少滑膜间质炎症细胞浸润,减缓关节破坏及骨破坏,显示出较好的治疗效果。

  自身免疫性的T细胞激活和增殖参与到多种自身免疫性疾病的发病机制中,其中包括类风湿关节炎,未致敏的CD4 T细胞经抗原刺激活化后成为CD4+T 淋巴细胞,CD4+T 淋巴细胞在不同因素作用下,进一步向Th1、Th2、Th17、Treg等功能性细胞类型分化[14]。Th1细胞亚群极化依赖于细胞因子IFN-g与IL-12,T-bet、STAT4作为Th1细胞转录因子,调控T细胞向Th1方向分化。Th1类细胞主要分泌IFN-g、IL-2、IL-12,其主要功能是促进细胞免疫反应,激活巨噬细胞和中性粒细胞,促进炎症因子释放。临床研究亦表明,RA患者关节炎液Th1细胞因子优势表达。流式细胞胞内染色结果显示,咖啡酸乙酯药物干预显著下调Th1细胞因子(IFN-g)的表达,而Th17 (IL-17A) 和Treg细胞表达无显著变化,在Th1体外分化细胞模型中,咖啡酸乙酯干预显著抑制了Th1的分化,确证咖啡酸乙酯特异性抑制Th1细胞免疫反应。

  最近这些年研究表明,细胞因子IFN-g在类风湿关节炎发病机制中扮演何种角色存在争议,既有RA疾病限制作用,又有促进疾病恶化功能,至今仍未给出满意解释。小鼠IFN-g基因敲除,通过IFN-g抑制IL-17的机制加重胶原关节炎小鼠发病程度[15]。大量研究显示,IFN-g在类风湿关节炎发病机制中扮演病理作用。在RA患者滑膜和关节炎腔中,IFN-g高表达。注射IFN-g抗体能显著降低CIA的发病率和疾病严重程度,与该结果一致,IFN-g或IFN-g受体基因敲除同样能降低胶原关节炎小鼠的发病率和严重程度[16]。这些结果表明,Th1细胞因子IFN-g在类风湿关节炎起着重要作用。大量研究已证实,两条信号通路参与Th1细胞因子IFN-g的产生,即(STAT1)/(T-bet)/IFN-g和IL-12/STAT4/ IFN-g信号通路 [17]。荧光定量PCR检测IFN-g产生相关通路的基因表达水平,结果显示,咖啡酸乙酯显著抑制IFN-g,T-bet,STAT1和STAT4的基因表达水平。基于此,我们推测咖啡酸乙酯可能通过干预IFN-g产生的关键信号通路,减少细胞因子IFN-g的产生及Th1免疫反应,从而介导对胶原关节炎的治疗作用。咖啡酸乙酯可能代表一种新的治疗类风湿关节炎的疗法,值得进一步研究。

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责任编辑:高燕仙
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