陈平  张鑫  张建博  范源*(云南中医学院 )

（本论文荣获“第二届兰茂中医药发展学术论坛”优秀论文三等奖）

　　摘要： 目的 比较新采摘的余甘子果实在5℃恒温条件和自然贮藏条件下其没食子酸、单宁酸、五没食子酰基葡萄糖（β-PGG）的含量变化。方法 新采摘余甘子果实分别置于5℃恒温的棕色密封广口瓶中及通风常温（一天中最高温度:28℃最低温度:23℃）室内自然条件下储藏，每3天用反向高效液相色谱法（RP-HPLC）测定没食子酸、单宁酸、β-PGG含量的变化。 结果 5℃恒温条件比自然储藏条件下余甘子中的没食子酸、单宁酸、β-PGG含量的变化趋势低且保持在一个相对稳定的低水平。结论 测定5℃恒温条件和自然储藏条件下余甘子褐变过程中没食子酸，单宁酸、β-PGG含量的变化，提示没食子酸、单宁酸、β-PGG可作为褐变过程中质控指标，5℃恒温条件下储藏余甘子果实、预防褐变优于自然贮藏条件下储藏余甘子果实。可为余甘子中药养护及褐变控制提供一定的参考。

　　关键词：余甘子；没食子酸；单宁酸；β-PGG；HPLC；储藏

RP-HPLC Method for Determination of Gallic Acid, Tannic Acid and β-PGG Content of Emblica in 5℃ Storage Condition and Natural Storage Condition CHEN Ping, ZHANG Xin, ZHANG Jian-bo, FAN Yuan(Yunnan University of Traditional Chinese Medicine )

　　【Abstract】Objective:Compared the determination of gallic acid，tannic acid and β-PGG content of fresh emblica in 5℃ storage condition and natural storage condition. Methods:Fresh emblica fruit is storaged in 5℃ temperature which is placed in Brown wide-mouth bottle, ventilation, natural temperature ( the highest temperature:28℃ the minimum temperature:23℃) and indoor natural condition. RP-HPLC method for determination of gallic acid, tannic acid and β-PGG content of emblica every three day. Results:Determination of gallic acid, tannic acid, beta -PGG content of emblica in 5℃ storage condition is lower than determination of emblica in natural storage condition. It is maintained at a low level and the stable is relatively. Conclusion:Determination of gallic acid, tannic acid and β-PGG content of emblica in 5℃ storage condition and natural storage condition. It is suggested that gallic acid, tannic acid, β-PGG as quality control indexes of browning. 5℃ storage condition is better than natural storage condition for storage fresh emblica and prevent of browning. It is provide some references for Chinese medicine conservation and browning control.

　　Key words:emblica   gallic acid   tannic acid   β-PGG    HPLC   storage

　　余甘子(PhyUanthus emblica或amla)是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(Phyllanthus)的一种生长在中国亚热带、热带部分地区，特别是干热河谷地区的落叶乔木或灌木资源植物。余甘子又称油甘子、滇橄榄、橄榄子、庵摩勒，在中国、印度等国家和我国中药、藏药等传统药物体系中应用极广，被应用于古代印度医学体系阿育吠陀养生学中，对普通感冒，坏血病，癌症和心脏疾病等具有治疗作用[1-2]。余甘子具有清热凉血，健胃消食，生津止渴等作用[3]且含有多种维生素、单宁、超氧化物歧化酶(SOD)等，具有较强的抗氧化作用。

　　余甘子果实含有酚类化合物主要诃尼酸(chebulinic acid)、鞣花酸(ellagic acid)、3-乙基没食子酸(3-ethoxy-gallic acid)、诃子酸(chebulagic acid)、没食子酸(gallic acid)等。挥发油类物质主要有β-波旁烯( β-bourbonene)、二十四醇(tetracosano1)、二十四烷(tetracosane)、丁香油酚(eugeno1)、 β-丁香烯( β-Caryophyllene）。此外，研究表明余甘子果实中蛋白质，维生素B 、B2、C及微量元素K、Zn、Mn含量丰富[4]。

　　由于余甘子贮藏过程中易发生褐变，贮藏时间短，影响产品质量，对余甘子鲜果品质造成影响[5]。褐变是植物界普遍存在的一种变色现象，植物经过一系列反应产生褐色聚合物的过程称褐变反应，简称褐变。鲜切中药从采摘开始，就存在一个自身的动态变化过程，即自身代谢过程。关于余甘子果实褐变的机制报道较少，本文测定其在5℃条件和自然储藏条件下褐变过程中没食子酸、单宁酸、β-PGG含量变化，对研究余甘子果实中药养护、褐变防控具有一定参考价值。

　　1、材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　云南楚雄采摘的新鲜余甘子果实。乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），丙酮（分析纯），正己烷（分析纯），磷酸（分析纯）均购自云南丹赤贸易有限公司，纯净水。β-PGG标准品（购自成都普瑞法科技开发有限公司，批号：14021908），没食子酸（购自云南昆明中检所，批号：110831-201204），单宁酸标准品（购自成都迈斯克医药科技有限公司，批号：130721）

　　1.2 仪器

　　D2KW-D电热恒温水浴锅，Agilent1200型高效液相色谱仪（VWD检测器），万分之一分析天平（购自北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 没食子酸、单宁酸、β-PGG对照品溶液的制备

　　精密称定没食子酸对照品0.40mg,用50%甲醇制成40ug/ml的溶液，备用。精密称取0.60 mg单宁酸对照品，用乙醇、水、丙酮（70：29：1）溶液溶解并定容，制备成浓度为60ug/ml的单宁酸标准溶液，备用。精密称定β-PGG对照品1 .00mg,用甲醇制成100ug/ml的溶液，备用。

　　1.3.2没食子酸、单宁酸、β-PGG供试品溶液的制备

　　没食子酸、单宁酸、β-PGG供试品溶液的制备：取25克去核余甘子果肉，精密称定，加入适量石英砂研磨，尽量捣碎，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，加热回流1.5小时,70°C。放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45um滤膜过滤。即得。

　　1.3.3  没食子酸含量测定方法

　　1.3.3.1 没食子酸色谱条件;

　　色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm, 5 um）；以甲醇-0.2%磷酸溶液（5：95）为流动相；检测波长为273 nm；柱温：25℃；进样量：10μl。

　　1.3.3.2 没食子酸线性关系考察

　　精密称取对照品0.50 mg，用50 %的甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，摇匀作为储备液摇匀作为储备液。按上述没食子酸色谱条件分别取3、5、7、9、11 ul不同体积进样，以没食子酸的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，得方程y=1233.1x+23.701，r=0.9983,结果表明：没食子酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0.15-0.55 ug。

　　1.3.4 单宁酸含量测定方法

　　1.3.4.1 单宁酸色谱条件

　　色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm, 5 um）；以甲醇-水（80：20）为流动相；检测波长为275 nm；柱温：25℃；进样量：2.0μl。

　　1.3.4.2 单宁酸线性关系考察

　　精密称取对照品0.80mg，用乙醇、水、丙酮（70：29：1）溶液溶解并定容至10 ml容量瓶中，摇匀作为储备液。按上述单宁酸色谱条件分别取3、5、7、9、11 ul不同体积进样，以单宁酸的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，得方程y=7281.2x+90.702，r=0.9999。结果表明：单宁酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0.24-0.88ug。

　　1.3.5 β-PGG 含量测定方法

　　1.3.5.1 β-PGG色谱条件

　　色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm, 5 um）；流动相：0min:乙腈-0.1%磷酸（10:90）,15 min: 乙腈-0.1%磷酸（25:75）,15.1 min: 乙腈-0.1%磷酸（25:75）,20 min：乙腈-0.1%磷酸（25:75）；检测波长为281 nm；柱温：25℃；进样量：20μl。

　　1.3.5.2 β-PGG线性关系考察

　　精密称取对照品1.0 mg，用50 %的甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，摇匀作为储备液摇匀作为储备液。按上述没食子酸色谱条件分别取13、15、17、19、21ul不同体积进样，以β-PGG的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，得方程y=2195.0x-47.357，r=1.0。结果表明：PGG峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为1.3-2.1 ug。

　　2、实验结果与分析

　　2.1 实验数据

　　表1 自然储藏条件和5℃储藏条件下没食子酸含量

　　表2 自然储藏条件和5℃储藏条件下单宁酸含量

　　表3 自然储藏条件和5℃储藏条件下β-PGG含量

图3 自然储藏条件5℃储藏条件下β-PGG含量

　　自然储藏条件下和5°C储藏条件下余甘子中没食子酸含量在前7天基本相同呈下降趋势。储藏后7天开始自然储藏条件下没食子酸含量迅速增加13天时达到最大，5°C储藏条件下没食子酸含量保持一个低水平的平稳趋势，见图1；自然储藏条件下和5°C储藏条件下前4天余甘子中单宁酸的含量变化相似呈下降趋势。4天——13天期间两种储藏条件下余甘子中单宁酸含量在10天时到达峰值，而自然储藏条件下余甘子中单宁酸含量的波动趋势明显大于5°C储藏条件下余甘子单宁酸含量的波动，见图2； 自然储藏条件下和5°C储藏条件下余甘子中β-PGG含量从第1天开始，自然储藏条件下β-PGG含量一直高于5°C储藏条件下β-PGG含量。在第4天以后，自然储藏条件和5°C储藏条件下余甘子中β-PGG含量总体呈上升趋势，见图3。

　　2.2 实验分析

　　余甘子果实中富含水解单宁是一种易水解的多酚化合物，其能在酸性、碱性条件下水解产生没食子酸、β-PGG等中间产物，这些中间产物之间存在相互转化的可能[6]。采摘后1——4天余甘子中单宁酸急剧减少推测其可能是因单宁酶水解作用使单宁酸为没食子酸和葡萄糖，而水解酶单宁酶是微生物单宁酸存在下产生的[7]。Yokotsuka等[9]研究从六个品种葡萄中提取的PPO的褐变底物，提出没食子酸被认为是PPO的主要底物。所以采摘后1——4天余甘子中没食子酸含量呈减少趋势，可能是因为没食子酸作为褐变底物与PPO结合而引起的[9-11]。

　　在没食子酸产生和余甘子褐变初期糖类物质存在的条件下，没食子酸与D-葡萄糖反应可生产β-PGG，β-PGG因HHDP基及没食子酰基的数目、结合位置等不同，可组成各种结构的物质，如木麻黄亭[8]。所以在褐变开始一定时间内，没食子酸都处于一个低水平状态，直到余甘子果实褐变到一定程度，糖类物质、HHDP基消耗到一定程度，没食子酸和β-PGG开始累积。一般认为水解单宁是通过莽草酸途径合成的，因此在褐变后期，单宁酸的含量又有所增高。

　　3、结论

　　本实验表明，自然储藏条件下储藏7天后余甘子中没食子酸含量变化明显，而5℃储藏条件没食子酸含量保持一个相对平稳的趋势，其褐变程度明显快于5℃储藏条件；自然储藏条件下余甘子中单宁酸、β-PGG的含量变化更明显。综上所述，本实验提示没食子酸、单宁酸、β-PGG特别是没食子酸可作为余甘子褐变过程中的质控指标，而在5℃储藏条件下余甘子中没食子酸、单宁酸、β-PGG的含量变化说明该储藏条件有利于余甘子保鲜，防止或延缓褐变。为进一步研究余甘子果实褐变机制、褐变防控提供一定的参考。

　　参考文献：

　　[1]杨顺楷，杨亚力，杨维力. 余甘子资源之物的研究与开发进展[J].2008，14 (6) ：846 - 854.

　　[2]S. M. Khopde, K. Indira Priyadarsini, H. Mohan et al.Characterizing the antioxidant activity of amla(Phyllanthus emblica) extract[J].CURRENT SCIENCE, 2001,81:185-190.

　　[3]郭建民，王建科，李玮等. 不同产地余甘子中没食子酸与槲皮素含量的测定[J].贵州农业科学, 2013, 41 (5) ：61 - 63.

　　[4]王辉.余甘子的化学成分和药理作用研究进展[J].中国现代中药,2011,13(11):52-56.

　　[5]范源，赵江盛，徐志平等. 余甘子中没食子酸等活性成分在自然储藏时的变化及分析[J]. 云南中医中药杂志.2014，35 (2) ：57 - 59.

　　[6]周国丽，郑仕萍，杨晓红.不同pH条件下五倍子中没食子酸、单宁酸、p—PGG含量测定及分析.云南中医中药杂志.2014,35(12):59-61.

　　[7]蔡淑娟,赵祥颖,刘建军.株产单宁酶酵母菌株的筛选[J].中国食品添加剂.2012,3:88-92.

　　[8]赵勇,王红,王宝恩.中药水解类鞣质PGG的研究进展[J].临床和实验医学杂志.2013,12(6):462-464.

　　[9]Yokotsuka k,Shimizu T,Shimizu T.Polyphenoloxidase from six mature grape varieties and their activies towards various phenols[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1991,71(3):156-162.

　　[10]蒋跃明,陈芳,张东林等.槟榔褐变底物的初步研究[J].热带作物学报.1992,13(2):93-96.

　　[11]陶月良,林叶,项小洁等.板栗种子褐变底物及其在不同组织中的含量差异[J].河北林果研究.2002,17(2):122-125.