万春平1 彭江云2 李兆福2 李小丝1 郑喜1 祁燕1 吴晶金2

（1云南中医学院第一附属医院中心实验室 2云南中医学院第一附属医院风湿科）

（本论文荣获“第三届兰茂论坛”优秀论文一等奖）

　　摘要 目的：研究温阳散寒除湿法（蠲痹颗粒）调控致病性Th17细胞/ 免疫抑制功能Treg之间平衡而介导治疗类风湿关节炎的作用机理，阐明扶阳学派及吴生元教授应用扶阳理论治疗类风湿关节炎临床优效的科学基础。方法：构建牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型，按临床评分平均分为CIA模型组，蠲痹颗粒醇提物组，关节炎临床评分法观察CIA小鼠关节炎发病严重程度；石蜡切片H＆E染色分别测定CIA小鼠足爪关节和关节炎病理损伤程度；流式细胞术检测胞内Th17、Treg细胞表达水平；荧光定量PCR法检测Th17细胞相关基因的表达。构建体外T细胞抗原受体（TCR）诱导T细胞体外活化模型，酶联免疫吸附法检测（ELISA）检测Th1、Th17 、IL-10及IL-6细胞因子产生水平；Western blot检测TCR信号诱导的纯化T细胞MAPK 信号通路（ERK、P38）磷酸化水平。

　　结果：蠲痹颗粒能显著降低CIA小鼠胶原关节炎的临床评分，明显改善CIA小鼠局部关节炎的症状（P＜0.05），减轻炎症细胞浸润，抑制CIA模型小鼠脾淋巴细胞胞内IL-17细胞因子和Th17细胞相关基因的表达，上调免疫抑制功能Treg的比例，从而维持Treg/Th17正常平衡。蠲痹颗粒醇提物体外给药显著抑制ConA和Anti-CD3诱导的T细胞增殖活性，显著降低Th1细胞因子（IFN-g）（P<0.01）、Th17细胞因子（IL-17A）（P<0.05）和促炎因子IL-6产生水平（P<0.05），上调IL-10的表达水平（P<0.05），抑制MAPK通路ERK 磷酸化水平；结论：温阳散寒除湿法可能通过调控Th17细胞/ Treg平衡和MAPK信号通路而介导治疗RA的作用， 这一作用机制可能为“温阳散寒除湿法治疗RA（寒湿痹阻）理论的现代生物学特征，该研究为扶阳学派及吴生元教授应用扶阳理论治疗RA临床提供科学基础，丰富和发展中医治疗痹证理论的科学内涵。

　　关键词：温阳散寒除湿法；蠲痹颗粒；类风湿关节炎；胶原关节炎；Th17细胞； 调节性T细胞；

　　温阳散寒除湿法（蠲痹颗粒）是云南省名老中医吴生元教授基于扶阳理论，总结出治疗类风湿关节炎有效治法，该方主要由附片、川芎、桂枝、五加皮等药味组成，具有温经散寒、祛风除湿、通络止痛之功，主治寒湿痹阻之类风湿关节炎。蠲痹颗粒的临床及实验研究显示：蠲痹颗粒能明显改善RA活动期（寒湿痹阻证）的临床症状，降低CRP、ESR、RF等指标，具有较好的临床疗效；实验研究亦表明，蠲痹颗粒具有抗炎和镇痛作用，对大鼠佐剂性关节炎（AA）和CIA小鼠胶原关节炎有显著抑制作用[1-3]。然而其治疗类风湿关节炎的作用机制尚未明确，因此有必要进一步深入研究。

　　最新研究表明，Treg、Th17细胞功能和分化过程具有共同之处却又相互对抗，其平衡失调影响着RA（Rheumatoid Arthritis，RA）发生与转归[4-6] ，本研究以Th17细胞/ Treg平衡为切入点，研究温阳散寒除湿法调控Th17细胞/ Treg平衡而介导治疗RA的作用机理，以期揭示 “温阳散寒除湿法治疗RA（寒湿痹阻）理论的现代生物学特征及内在规律。

　　1、材料与试剂

　　1.1 动物  BALB/c小鼠，雌性，7-8周龄，体重18g左右； DBA/1小鼠，雄性7-8周龄，体重20g左右，均购自成都达硕生物科技有限公司，合格证号SCXK(川) 2008-24；动物饲养在SPF级动物房，实验动物至少饲养1周后使用。温度（22±1）℃，湿度55%±5%，12h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。

　　1.2 药物

　　1.2.1 蠲痹颗粒浸膏醇提物的制备：称取289.4g蠲痹颗粒浸膏，用蒸馏水溶液溶解混匀，在搅拌下加入乙醇，使含醇量达到80%，静置12h，离心，倾出上清液，过滤，滤液减压回收乙醇，得蠲痹颗粒药材浸膏，将浸膏放入真空干燥箱进行真空干燥2天左右，收获固体浸膏，得蠲痹颗粒浸膏3.658g，折合原药材：1g醇提物相当于79.11g蠲痹颗粒浸膏。

　　1.2.2 试剂  牛II型胶原、弗氏完全佐剂（CFA）购自Sigma公司(St．Louis．MO，USA)； APC-小鼠IL-17A抗体（TC11-18H10）、FITC-小鼠IFN-γ抗体（XMG1.2）、PE-Cy7小鼠CD4抗体(RM4.5)、PE-小鼠Foxp3（MF23）抗体购自BD PharMingen 公司(San Diego，CA，USA)；IL-10、IL-6、IL-17A 和IFN-g细胞因子ELISA检测试剂盒购自BD PharMingen 公司(San Diego，CA，USA)RPMI-1640培养基购自GibcoBRL公司 (life Technologies，Grandisland，NY，USA)；其他试剂为国产分析纯。

　　1.3主要仪器

　　3111二氧化碳培养箱购自美国Thermo-fisher；流式细胞仪购自美国BD Biosciences。Megafugel1.0R离心机来自德国Thermo Scientific Heraeus）RM2235石蜡切片机（德国莱卡仪器有限公司）、EG1150H+EG1130C组织包埋机、HI1210烘片机、DM2500正置显微镜、ASP300S全自动组织脱水机均购置德国莱卡仪器有限公司。

　　2、实验方法及评价

　　2.1关节炎的诱导及病变评定

　　DBA/1小鼠胶原关节炎的诱导参照文献制备[3]，具体方法：牛II型胶原加入0.1M的醋酸，浓度10mg/ml，提前1天4℃冰箱溶解，胶原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，待雄性DBA/1小鼠麻醉后，于其尾根部进行致敏，每只50ml/只，3周后以相同剂量进行再次免疫攻击，肉眼观察小鼠四肢，对关节炎的严重程度进行0-4级评分，每组小鼠四肢评分总和除以小鼠只数，取平均值作为临床评分。[0-4级评分系统：0=正常；1=一个或多个趾关节红或红肿；2=踝关节以下中度红肿；3=包括膝关节在内的严重红肿；4=包括膝关节在内的完全红肿，关节变形、残废。每只小鼠最多评分为16分]。第0天即为攻击当天。

　　2.2实验分组及给药

　　攻击1周后，模型小鼠开始出现关节红肿，按临床评分平均分为CIA模型组，蠲痹颗粒醇提物组，每组10只。CIA模型组给予溶剂对照，蠲痹颗粒组口服给予蠲痹颗粒醇提物21mg/kg（相当于生药2.16g/kg）。以上给药均在攻击1周后开始给药，1次/天。给药量按照实验动物与人用药量的换算公式计算得出。

　　2.3 指标检测

　　2.3.1 细胞制备

　　再次免疫20天后，脱脊椎处死小鼠，无菌取其脾脏，制备单细胞悬液，红细胞裂解液除红细胞，用含2%FBS的RPMI-1640冼两次，并将细胞调至所需浓度。

　　2.3.2 组织病理学检测

　　小鼠处死后，取其后肢，去毛后于10%福尔马林进行固定，之后脱钙和进行石蜡包埋，切片（5mm厚度），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H&E）染色后显微镜下观察，出现滑膜炎、血管翳面伴随少量软骨侵蚀；2=中度改变，出现大面积软骨缺失、侵蚀的血管翳面以及伴随着单个核细胞和多形核细胞侵润的滑膜增生；3=严重的滑膜炎，关节和骨侵蚀；4=关节结构的完全破坏。

　　2.3.3 流式细胞术（FACs）检测

　　对胞内细胞因子染色：各组1×106个小鼠脾淋巴细胞与PMA、Ionomycin以及BFA于5%CO2培养箱中共培养4h后，收集细胞，冼液冼2次，加入IgG抗体，封闭FcR，进行表面标志CD4染色。完毕后，固定、穿膜，加入荧光标记的抗IL-17抗体，流式细胞仪检测分析。对于Treg细胞的检测，无需上述刺激，按胞内细胞因子染色检测，Flowjo软件分析。

　　2.3.4 蠲痹颗粒醇提物对CD4+T细胞细胞因子产生作用

　　CD4+ T淋巴细胞（4×105个/孔）接种于anti-CD3 mAb（5mg/ml）包被的24孔培养板中，同时加入不同浓度的蠲痹颗粒提取物。细胞于含5%CO2培养箱中培养36h，收集培养上清，酶联免疫吸附法（ELISA）法检测上清中IL-10、IL-6、IFN-g和L-17A的水平。

　　2.3.5 荧光定量PCR检测Th17细胞相关基因的表达

　　抽提1×107个小鼠脾淋巴细胞，应用Trizol试剂盒提取总RNA，按Takara逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。尔后应用SYBR GreenI嵌合荧光法在实时定量PCR仪进行Th17细胞相关基因（IL-17A、IL-17F、IL-21、 IL-23p19和RORgt）表达检测，相关引物由上海生物工程有限公司合成公司合成。在PCR反应程序结束后，进入仪器自带软件的数据分析界面，设置β-actin为内参基因，仪器自动计算出各实验组基因表达差异倍数及标准差，即2-△△Ct±标准差值。特异基因引物系列如下：

　　2.3. 6蠲痹颗粒醇提物对CD4+T细胞MAPK信号通路的影响

　　PBS稀释的anti-CD3 mAb （5mg/ml） 加入24孔培养板，于4℃包被过夜 ，用PBS洗两次。加入CD4+ T淋巴细胞 （5×106个/孔）、anti-CD28 mAb（2mg/ml） 和不同浓度的蠲痹颗粒提取物，刺激作用30min，另设无刺激剂对照组。收集细胞于Eppendorf管中，裂解细胞，BCA蛋白定量试剂调成统一浓度后， 100℃水浴煮沸5-10min，提取总蛋白。垂直电泳分离、转膜、封闭，分别加入抗p-ERK、p-JNK、p-P38和总的ERK、P-38，4℃过夜，加入相应的二抗，曝光、定影、拍照。

　　2.4. 统计分析

　　所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析，数据统计均以平均值±标准差表示，以P﹤0.05为显著水平。数据统计分析采用SPSS17.0统计软件包。

　　3、实验结果

　　3.1 蠲痹颗粒醇提物对正常小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响。

　　图 1.A 结果显示，丝裂原ConA能够显著诱导正常小鼠T淋巴细胞增殖活性，蠲痹颗粒醇提物30mg/ml药物干预后，能够显著抑制ConA诱导正常小鼠T淋巴细胞增殖作用，经统计学处理，差异有显著性意义（P<0.01）；图1.B结果表明，蠲痹颗粒醇提物30mg/ml显著抑制anti-CD3 mAb诱导正常小鼠脾脏T淋巴细胞活化，差异有显著性意义（P<0.01）。丝裂原细菌脂多糖（LPS）显著刺激正常小鼠B淋巴细胞增殖活性，蠲痹颗粒醇提物30mg/ml药物干预显著抑制正常小鼠B淋巴细胞的增殖活性，差异有（P<0.01），结果见图1.C。结果见图1.显示，蠲痹颗粒醇提物在浓度3-30mg/ml对正常脾淋巴细胞活度无明显的影响（P>0.05），提示蠲痹颗粒醇提物在3-30mg/ml对正常小鼠淋巴细胞无细胞毒性作用。上述结果提示，蠲痹颗粒醇提物具有显著的免疫抑制活性，在防治类风湿关节炎具有较好的应用前景。

　　图 1. 蠲痹颗粒醇提物对正常小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响。正常小鼠脾淋巴细胞，与不同浓度的蠲痹颗粒醇提物在丝裂原（ConA 或LPS）或anti-CD3 mAb刺激下共培养48 h ， MTT法检测淋巴细胞的增殖活性。A.蠲痹颗粒醇提物对ConA诱导的T淋巴细胞增殖功能的影响;B.蠲痹颗粒醇提物对LPS诱导的B淋巴细胞增殖功能的影响.C. 蠲痹颗粒醇提物对anti-CD3 mAb诱导T淋巴细胞增殖作用的影响。D. 蠲痹颗粒醇提物对正常小鼠脾淋巴细胞细胞毒性作用（MTT法）；结果以mean±SD.表示。*P<0.05，**P<0.01，对照组vs蠲痹颗粒醇提物干预组。

　　3.2 蠲痹颗粒醇提物对胶原关节炎模型小鼠的药效学

　　Fig2A结果显示，蠲痹颗粒口服给予1.89g/kg浸膏药物干预后，显著降低胶原关节炎小鼠临床评分，其中在再次免疫后的第12天差异有显著性意义（P﹤0.05）。病理组织检测结果表明，与正常DBA/1小鼠相比较，在CIA模型组小鼠中观察到典型的关节炎病理表现：大量的淋巴细胞浸润、滑膜组织增生、软骨和骨的侵蚀等，而蠲痹颗粒组小鼠明显阻止关节炎滑膜炎、淋巴细胞浸润和关节损，与CIA模型组比较，差异有显著性意义（P＜0.05），见Fig2B。

　　图 2. 蠲痹颗粒醇提物对胶原关节炎模型小鼠的治疗作用。构建胶原诱导的关节炎模型，蠲痹颗粒醇药物干预，肉眼观察小鼠四肢，对关节炎的严重程度进行0-4级评分，药物干预后，获取后肢，行HE染色，评价关节病理损伤程度A. 临床评分结果；B.组织病理H&E.染色。结果以mean±SD.表示。*P<0.05，**P<0.01，对照组vs蠲痹颗粒醇提物干预组。

　　3.3  蠲痹颗粒醇提物对CIA模型小鼠调节性T细胞作用的影响

流式细胞术检测脾淋巴细胞Foxp3+CD4+T(调节性T细胞)表达水平，结果显示， 与CIA模型对照组比较，蠲痹颗粒干预后， 脾淋巴细胞CD4+T细胞无明显变化（P＞0.05），Foxp3+CD4+T（调节性T细胞）表达水平显著上调，差异有显著性意义（P＜0.05），见Figure3A、3B。

　　图3 温阳散寒除湿法对CIA模型小鼠Treg细胞的影响。收集各组1×106个小鼠脾淋巴细胞细胞，封闭FcR，进行表面标志染色。完毕后，固定、穿膜，加入荧光标记的抗Foxp3抗体，流式细胞仪检测分析。结果以mean±SD.表示。*P<0.05，**P<0.01，对照组vs蠲痹颗粒醇提物干预组

　　3.4 蠲痹颗粒醇提物对CIA模型小鼠Treg/Th17平衡调控作用的影响

　　流式细胞术检测脾淋巴细胞CD4+ T细胞内的IL-17A表达情况。结果显示，与CIA模型对照组比较，蠲痹颗粒干预后，其IL-17A表达显著下调，差异有显著性意义（P＜0.05）。Treg/Th17比值反应Treg/Th17平衡状态，结果显示，蠲痹颗粒干预后，显著增加Treg/Th17比值，差异有显著性意义（P＜0.05）。

　　图4. 温阳散寒除湿法对CIA模型小鼠CD4+ T细胞胞内IL-17A表达的影响

　　各组1×106个小鼠脾淋巴细胞与PMA、Ionomycin以及BFA于5%CO2培养箱中共培养4h后，收集细胞，封闭FcR，进行表面标志染色。完毕后，固定、穿膜，加入荧光标记的抗IL-17、抗体，流式细胞仪检测分析。结果以mean±SD.表示。*P<0.05，**P<0.01，对照组vs蠲痹颗粒醇提物干预组

　　3.5 蠲痹颗粒醇提物对CIA模型小鼠Th17相关基因表达的影响

为进一步揭示蠲痹颗粒醇提物对Th17调控作用的机制，我们应用荧光定量PCR检测Th17相关基因表达水平，结果显示蠲痹颗粒醇提物显著抑制CIA模型小鼠脾淋巴细胞IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-23p19的mRNA的表达水平，下调Th17转录因子RORgt的转录水平，差异有显著性意义（P＜0.05）。

　　图4. 温阳散寒除湿法对CIA模型小鼠细胞Th17细胞相关基因表达的影响

　　抽提1×107个小鼠脾淋巴细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA。应用SYBR嵌合荧光法在实时定量PCR仪进行Th17细胞相关基因表达检测。结果以mean±SD.表示。*P<0.05，**P<0.01，对照组vs蠲痹颗粒醇提物干预组

　　3.6 蠲痹颗粒醇提物对TCR信号诱导的CD4+T淋巴细胞细胞因子产生的影响

　　为揭示蠲痹颗粒治疗类风湿关节炎的作用机制，本研究进一步应用ELISA法检测蠲痹颗粒醇提物对anti-CD3 mAb诱导CD4+T淋巴细胞细胞因子产生的影响。ELISA检测结果显示，结果如图6， 蠲痹颗粒醇提物药物干预后，显著降低Th1细胞因子（IFN-g）和Th17细胞因子（IL-17A）产生水平，差异有显著性意义（P<0.05和P<0.01）。同时显著提高负调控细胞因子IL-10的产生水平，降低促炎细胞因子IL-6水平，差异有显著意义（P<0.05）。

　　图 6. 蠲痹颗粒醇提物对anti-CD3 mAb诱导CD4+T淋巴细胞Th1/Th17细胞因子产生的影响。4×106/ml CD4+T淋巴细胞接种于anti-CD3 mAb(5mg/ml)包被的24孔板中，同时加入不同浓度的蠲痹颗粒醇提物，共培养36 h，离心收集培养上清 ( 5000 rpm，4℃，5 min )，ELISA法检测培养上清IL-17A（A）、IFN-g（B）、IL-6（C）和IL-10（D）的浓度。结果以mean±SD.表示。*P<0.05，**P<0.01，对照组vs蠲痹颗粒醇提物干预组。

　　3.7蠲痹颗粒醇提物对TCR信号诱导的CD4+T淋巴细胞MAPK信号通路的影响

　　MAPK信号通路是参与TCR信号转导的重要途径。为揭示蠲痹颗粒醇提物免疫抑制作用的分子机制，我们应用Western blot 检测MAPK信号通路P-38和ERK磷酸化水平，结果显示，蠲痹颗粒醇提物在30、100mg/ml显著抑制ERK的磷酸化水平，100mg/ml药物干预 明显下调P-38磷酸化。

　　图 7. 蠲痹颗粒醇提物对anti-CD3 mAb诱导CD4+T淋巴细胞MAPK信号通路的影响。4×106/ml CD4+T淋巴细胞接种于anti-CD3 mAb(5mg/ml)包被的24孔板中，同时加入不同浓度的蠲痹颗粒醇提物，作用1h，提取总蛋白，Western blot 法检测CD4+T淋巴细胞p38和ERK磷酸化水平。

　　4、讨论

　　大量的研究表明，Treg、Th17细胞都来源于初始T细胞，其功能和分化过程相互对抗，在正常情况下两者保持平衡，有利于机体的免疫稳定状态的维持。在炎症反应、自身免疫性疾病时，促炎症细胞因子的过度表达通过影响初始T细胞的分化格局，增加Th17细胞的分化，破坏Th17细胞/ Treg之间的平衡，导致一系列炎症反应和组织损伤，其中TGF-b、IL-6是连接Treg与Th17最关键的细胞因子[4-6]。在体外研究中，TGF-b通过诱导Foxp3的表达，拮抗RORgt的功能，从而抑制Th17细胞分化[7]。在炎症反应、感染时，IL-6抑制Treg分化，与TGF- b联合诱导初始CD4+T向Th17细胞分化[6]。总之，Treg、Th17细胞功能和分化过程具有共同之处却又相互对抗，其平衡失调影响着RA发生与转归。

　　温阳散寒除湿方（蠲痹颗粒）的临床及实验研究表明，蠲痹颗粒具有良好的临床疗效，且对大鼠佐剂性关节炎（AA）和CIA小鼠胶原关节炎有显著抑制作用，作用机制可能通过诱导非特异性抑制性细胞因子IL-10的产生而发挥负性调节作用，从而阻止RA的发展与转归。基于此，本研究进一步在牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎疾病动物模型上，探讨蠲痹颗粒醇提物通过Treg/Th17细胞介导治疗类风湿关节炎的作用机制。与前期研究一致，蠲痹颗粒醇提物明显阻止关节炎滑膜炎、淋巴细胞浸润和关节损和临床评分。流式检测结果表明，蠲痹颗粒醇提物干预后显著下调介导炎症作用Th17细胞表达，上调具有免疫抑制作用Treg细胞表达水平，即维持着Th17细胞/ Treg之间的平衡。Th17细胞亚群是一种与IL-23相关且能分泌IL-17新发现Th亚群，主要分泌IL-17A，IL-17F，IL-21等，其主要介导机体的炎性反应（防御胞外病原菌的感染）、自身免疫性反应等的发生和发展，具有高致病性[8]。转录因子RORgt在Th17产生和分化过程中起重要调控作用[9]。qPCR结果显示，蠲痹颗粒醇提物药物干预后显著下调Th17相关基因IL-17A，IL-17F，IL-23p19 、IL-21及转录因子RORgt  mRNA表达水平。在TCR诱导纯化T细胞活化模型中，蠲痹颗粒醇提物体外给药亦减少Th17分化所需的关键细胞因子IL-6的分泌，综合上述研究结果推测，蠲痹颗粒醇提物药物可能通过干预Th17分化所需的关键细胞因子及转录因子的表达，阻止了CD4+T细胞向高致病性Th17细胞分化，同时通过减少IL-6的表达，上调具有免疫抑制功能Treg细胞的表达，从而维持Treg/Th17正常平衡，从而介导对RA的防治作用。

　　T细胞激活信号通过多种途径转导入细胞核，其中MAPK信号通路是参与TCR信号转导的重要途径。MAPK的三种主要成分：ERK、JNK以及P38均参与T细胞激活。MAPK信号通路的激活，分别导致不同核转录因的激活，调控T细胞增殖 、细胞因子分泌等[10]。蠲痹颗粒醇提物抑制免疫的分子机制，我们进一步应用Western blot 检测蠲痹颗粒醇提物对TCR信号诱导的纯化MAPK信号通路的影响，结果表明，蠲痹颗粒醇提物显著抑制ERK和P38的磷酸化水平，提示抑制MAPK信号通路，可能是蠲痹颗粒免疫抑制作用及治疗类风湿关节炎的分子机制之一。

　　温阳散寒除湿法调控Th17细胞/ Treg平衡和MAPK信号通路而介导治疗RA的作用， 这一作用机制可能为“温阳散寒除湿法治疗RA（寒湿痹阻）理论的现代生物学特征，本研究为扶阳学派及吴生元教授应用扶阳理论治疗RA临床提供科学基础，丰富和发展中医治疗痹证理论的科学内涵。

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